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Bacillus subtilisBeschreibung und CharakterisierungBacillus subtilis, der gemeine Heubazillus, ist ubiquitär verbreitet und kann aus Wasser, Luft und Boden, in besonders großer Menge aus Komposterde (bis 107 cfu / g, ALEXANDER, 1977), isoliert werden. B. subtilis läßt sich im Heuaufguß (Heubazillus) problemlos anreichern. Die zwei Mikrometer langen stäbchenförmigen Zellen sind peritrich begeißelt, können sich schnell fortbewegen und werden von einer Gram-positiven Zellwand umgeben, die einem Zellinnendruck von ca. 20 atm standhalten muß.B. subtilis ernährt sich chemoorganoheterotroph und besiedelt sowohl die Rhizosphäre als auch die oberen Schichten des Bodens. Dort hat er aufgrund seiner saprophytischen Lebensweise Anteil an der Mobilisierung und Mineralisierung organischer Stoffe und deren Rückführung in die Nahrungskreisläufe. Er besitzt ein großes Arsenal an Glukan- und Protein-abbauenden Enzymen, die bei Bedarf aus der Zelle exportiert werden. Solange ausreichend Nährstoffe und Sauerstoff vorhanden sind, erreicht B. subtilis unter ansonsten ebenfalls günstigen Lebensbedingungen Generationszeiten von ca. 45 min. Als Kohlenstoff- und Energiequelle wird in erster Präferenz Glukose genutzt. Bei ausreichender Konzentration reprimiert Glukose die Expression sämtlicher Gene, deren Produkte für die Nutzung alternativer C-Quellen verantwortlich sind (HUECK & HILLEN, 1995; STÜLKE & HILLEN, 2000). Zur Energiegewinnung dient Sauerstoff als bevorzugter terminaler Elektronenakzeptor. Auch hier wird die Nutzung alternativ in Frage kommender Substrate bei Sauerstoffzutritt unterdrückt. Unter anaeroben Bedingungen können die Zellen bei Glukose- und Nitrat-Anwesenheit noch genug Energie für langsames Wachstum (CLAUS & BERKELEY, 1986) durch Nitrat-Atmung (CRUZ RAMOS et al., 2000) erzeugen. Sind keine als Elektronenakzeptor nutzbaren Substrate verfügbar, dann ist B. subtilis in der Lage, auch ausschließlich durch Substratkettenphosphorylierung über die Glykolyse verwertbarer Zucker bei Erzeugung von Milchsäure, Ethanol, Acetoin und 2,3-Butandiol Gärungsstoffwechsel zu betreiben (NAKANO et al., 1997; CRUZ RAMOS et al., 2000). Taxonomisch zählt man B. subtilis zu den Eubakterien (Bacteria), genauer zu den Gram-positiven (Firmicutes). Dort wird er der Klasse der Bazillen und Clostridien zugeordnet (niedriger G+C-Gehalt). Dieser Klasse untergeordnet ist die Bazillus-Staphylokokken-Gruppe, welche unter anderem die Familie Bacillaceae mit der Gattung Bacillus (ca. 150 Arten) einschließt (CLAUS & BERKELEY, 1986). Die phylogenetische Nähe zu Pathogenen wie Staphylokokken, Listerien, Mykobakterien und Mykoplasmen macht B. subtilis besonders interessant für die molekularbiologische und -medizinische Forschung. Die Erstbeschreibung erfolgte durch Ehrenberg im Jahr 1835 als Vibrio subtilis. Durch Cohn wurde 1872 V. subtilis zu Bacillus subtilis umbenannt und von Fisher 1895 gleichnamiger Gattung zugeordnet (GORDON, 1981). Die erste dokumentierte medizinische Anwendung von B. subtilis erfolgte 1941 durch die Sanitätsabteilung des Afrikakorps der deutschen Wehrmacht während des Feldzuges in Libyen. Weil einer Ruhr-Epidemie zahlreiche Soldaten zum Opfer fielen, bestand der dringende Bedarf an Medikamenten. Antibiotika waren noch nicht verfügbar. Nachforschungen vor Ort ergaben, daß die Ruhr bei der einheimischen Bevölkerung erfolgreich durch die orale Verabreichung frischen, noch warmen Kameldungs behandelt wurde. Für den Behandlungserfolg machte man den schließlich in großer Zahl gefundenen B. subtilis verantwortlich (ROTHSCHILD, zitiert durch D. L. WOLFE, 1993). Noch heute wird B. subtilis in der Humanmedizin angewandt. In der Roten Liste® der in Deutschland verfügbaren Fertigarzneimittel von 1997 (Rote Liste®, 1997) stößt man beispielsweise auf die Präparate Utilin®, Utilin N® und Bactisubtil®, die Zellen oder Sporen von B. subtilis als Lyophilisate oder Suspensionen enthalten und zur Behandlung von chronischen Dermatosen bzw. von Durchfall, Gärungs- und Fäulnisdyspepsien, Enteritis, Enterocolitis oder von intestinalen Störungen chemo- oder strahlentherapierter Krebspatienten angewendet werden. Aufgrund der hohen Hitzeresistenz der B. subtilis-Sporen werden diese auch als Indikator bei entsprechenden Sterilisationsprozessen in Pharmazie, Medizin und Lebensmittelindustrie eingesetzt. In der Landwirtschaft dient das Bakterium als biologisches Fungizid für Samen von beispielsweise Baumwolle, Gemüse, Erdnüssen und Sojabohnen; es besiedelt während der Keimung das Wurzelsystem und beugt durch Konkurrenz Verpilzungen vor. Aufgrund seiner Fähigkeit zur Sekretion extrazellulärer Enzyme wird B. subtilils insbesondere für die Herstellung von Waschmittelenzymen, aber außerdem auch für die Synthese von Riboflavin (Vitamin B2) in der biotechnologischen Industrie genutzt. Wegen seiner viefältigen Anwendung und seiner Rolle als der am besten untersuchte Gram-positive Modellkeim wurde 1990 mit der Durchsequenzierung des gesamten B. subtilis-Genoms begonnen. Das Ergebnis wurde 1997 vorgestellt und umfaßte einen 4 214 814 Basenpaare langen zirkulären DNA-Doppelstrang mit 1 834 190 GCs (43,52 %) und 2 380 624 ATs (56,48 %) pro Strang. Die codierende Sequenz nimmt 3 661 210 Nukleotide (86,87 %) der Gesamtsequenz in Anspruch, positive intergenische Bereiche 16,63 %. Desweiteren wurden Gene für 88 tRNAs und 30 rRNAs gefunden (KUNST et al., 1997). Die Angaben zur Anzahl der theoretisch ermittelten offenen Leserahmen schwankt zwischen 4098 und 4100, darunter Gene für 77 ABC-Transporter, 5 Signalpeptidasen, 18 sigma-Faktoren, 34 Zweikomponentensysteme sowie Regulatoren der GntR-Familie (20), der LysR-Familie (19), der LacI-Familie (12), der AraC-Familie (11) und der Lrp-Familie (7), viele mit noch nicht beschriebener Funktion. Das durchschnittliche Gen ist 893,41 Nukleotide, das längste 14 793 und das kürzeste vorausgesagte 63 lang (KUNST ET AL., 1997). Organismus und UmweltIn seiner natürlichen Umwelt, den oberen Schichten des Bodens, wird B. subtilis mit einer Vielzahl biotischer und abiotischer Faktoren konfrontiert. Wegen der Lage seines Biotops unweit der bodennahen Luftschicht, ist er Schwankungen der Lufttemperatur und der Luftfeuchte relativ ungeschützt ausgesetzt. Durch die normale Sonneneinstrahlung können nahe der Bodenoberfläche Temperaturen um ca. 50 °C durchaus erreicht werden. Die eintretende Verdunstung kann zum Absinken der Wasseraktivität und zur Ausbildung hoher Ionenstärken und osmotischer Drücke führen, einsetzender Regen zum hypoosmotischen Schock. Aufgrund ihrer geringen Größe (großes Oberflächen/Volumen-Verhältnis) müssen sich gerade Mikroorganismen mit diesen Schwankungen ihrer Lebensbedingungen besonders intensiv auseinandersetzen. Nähern sich diese Schwankungen der Lebensbedingungen den Grenzen des ökologischen Toleranzbereiches des Organismus, so spricht man von Streß.Trotz ihrer morphologischen Abgegrenztheit sind alle Organismen thermodynamisch offene Systeme. Sie befinden sich in ständigem Stoff- und Energieaustausch mit ihrer Umwelt. Darum ist es für das Überleben und zur Erhaltung der Zellintegrität und aller Zellstrukturen zwingend notwendig, fortwährend Energie aufzuwenden und mit den fast immer nur begrenzt vorhandenen Ressourcen möglichst effektiv umzugehen. Während eine kontrollierte Umgebung im Labor optimale Wachstumsbedingungen gewährleisten kann, sind in der natürlichen Umwelt eher Mangel und widrige Umwelteinflüsse die Normalität. Es wirken entweder alleinig oder in fast allen denkbaren Konstellationen Hitze, hyperosmotischer oder hypoosmotischer Streß, Schwermetallstreß, pH-Wert-Änderungen, Mangel an Nahrungs- und Energiequellen, Sauerstofflimitation, chemische Radikale und daraus resultierende Zellschäden, virale Infektionen usw. Folglich ist der Mikroorganismus in seiner natürlichen Umwelt fast ständig Streß- und Hungersituationen ausgesetzt und muß sich so gut wie möglich an die stets wechselnden Umweltbedingungen anpassen, um in der Konkurrenz um Nahrung und Lebensraum zu bestehen und sein bzw. das Überleben seiner Art zu sichern (HECKER & BABEL 1988). B. subtilis wurde während seiner Evolution für das Überleben in seinem Lebensraum selektiert. Nur diejenigen adaptierten Individuen überlebten, die befähigt waren, den oben genannten Widrigkeiten durch verschiedene Strategien zu begegnen und sich mit den Umweltbedingungen zu arrangieren. B. subtilis hat wahrscheinlich 4 099 proteinkodierende Gene (KUNST et al., 1997), von deren Produkten zu einem beliebigen Zeitpunkt ca. die Hälfte gebraucht wird und aktiv ist. Da eine Bakterienzelle keine Proteine "lagern" kann und viele Genprodukte Reaktionen katalysieren, die nicht unter allen Bedingungen erwünscht sind, sind die anderen 50 % der Gene "stumm" und kommen nur bei entsprechenden Umweltbedingungen zur Expression. Bei Einwirkung von Streß muß die Zelle darauf schnellstmöglich mit entsprechender Anpassung durch Umstellung ihres Genexpressionsprogrammes (differentielle Genexpression) reagieren. Dies geschieht über ein komplexes Netzwerk ineinandergreifender Signalwandlungssysteme, welche extrazelluläre Signale empfangen (Sensoren) und in für die Zelle verwertbare interne Signale umwandeln (Signalwandlungskaskaden, Response-Regulatoren, Alarmone). Dies führt zur Aktivierung von Genen, die eine offensive Auseinandersetzung mit dem Stressor oder dessen Beseitigung ermöglichen oder für defensive Strategien wie Reparatur und Schutz von Zellstrukturen verantwortlich sind. Gleichzeitig werden diejenigen Gene reprimiert, deren Produkte fur die momentane Situation unnötig sind oder deren Expression eine Verschwendung von ohnehin knappen Ressourcen darstellen würde. Die abgestimmte Steuerung des Genexpressionsprogrammes wird durch die Organisation der Gene in regulatorischen Gruppen ermöglicht. Dabei werden Operons (Gengruppen, welche durch denselben Promoter bzw. Operator...), Regulons (Gengruppen, welche durch das gleiche Regulatorprotein...) und Stimulons (Gengruppen, welche durch das gleiche extrazelluläre Signal - Stimulus - gesteuert werden) unterschieden (VANBOGELEN & NEIDHARDT, 1990). Moduliert ein zweiter oder weiterer Regulator die Expression eines Regulons, so spricht man vom Modulon. Als Regulatoren auf Genexpressionsebene fungieren DNA-bindende Proteine, welche die Bindung bzw. die Aktivitat der RNA-Polymerase in der Promotor-Region eines Gens bzw. Operons fördem (Aktivatoren), hemmen (Repressoren) oder aber erst ermöglichen. Zu letzteren gehören die Sigma-Faktoren, die durch Erkennung und Bindung eines spezifischen DNA-Motivs in der Promotorregion und Bindung der RNA-Polymerase die Transkription ermöglichen. Neben dem Sigma-Faktor SigmaA, der für die Expression der vegetativen Gene verantwortlich ist, verfügt B. subtilis über 17 weitere alternative Sigma-Faktoren (KUNST et al., 1997), die die Aktivität von Gengruppen beeinflussen können. Dazu gehört zum Beispiel SigmaB, der als erster alternativer Sigma-Faktor neben SigmaA entdeckt wurde (HALDENWANG et al., 1979), dessen Funktion aber noch fast 15 Jahre unbekannt blieb. Den wohl komplexesten und eindrucksvollsten Regulationsmechanismus der Genexpression über alternative Sigma-Faktoren bei Prokaryoten stellt die Sporulationskaskade in B. subtilis dar, bei der durch das Signal Nährstofflimitation über eine verzweigte Kaskade von Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen von Sensoren und Response-Regulatorproteinen (SpoOA-Phosphorelay - HOCH, 1995) in einer festgelegten Reihenfolge fünf verschiedene Sigma-Faktoren abwechselnd in Sporenmutter- und sporulierender Zelle in Aktion treten und zur Expression von Genen führen, deren Produkte bei der Sporenbildung benötigt werden (STRAGIER & LOSICK, 1990; LOSICK & STRAGIER, 1992). Die entstehende stoffwechselinaktive, dormante Endospore ist resistent gegen Austrocknung, Bestrahlung und hohe Temperaturen sowie andere mögliche Stressoren und stellt somit einen hervorragenden Schutz gegen widrige Umwelteinflüsse dar (CLAUS & BERKELEY, 1986). 60 bis 100 % der im natürlichen Habitat nachgewiesenen Bazillen kommen als Sporen vor (ALEXANDER, 1977). Der Nachteil für B. subtilis bei der Sporenbildung besteht jedoch im Aufgeben besiedelten Lebensraumes und im Ausschluß von der Vermehrung und von evolutionären Prozessen. Darum kommt die Sporenbildung in der Reaktion auf überlebensgefährdende Umweltbedingungen nur für Teile der B. subtilis-Population oder als letzter Ausweg in Betracht. Bevor es zur Sporulation kommt, verfolgt B. subtilis daher alternative Strategien, sich mit Streß- bzw. Hunger-Situationen auseinanderzusetzen. Dazu gehören beispielsweise die Ausbildung von Flagellen und die Chemotaxis, die Bildung von Osmoprotektiva in Reaktion auf osmotischen Streß, die Regulation des C-Quellen-Metabolismus über die Aufhebung der C-Katabolitenrepression bei Glukose-Abwesenheit, die Regulation des N-Stoffwechsels u. a. über die Anhäufung des Alarmons ppGpp und die folgende stringent response (NISHINO et al., 1979, HECKER et al., 1987, WENDRICH & MARAHIEL, 1997), die Ausbildung der Kompetenz, die Bildung extrazellulärer Enzyme zur Erschließung neuer Nahrungsquellen, die Ausscheidung von Antibiotika zur Hemmung von Konkurrenten oder die generelle Streßantwort (HECKER et al., 1996; HECKER & VÖLKER, 1998; PRICE, 2000). Für die Initialisierung der generellen Streßantwort wird SigmaB über Energielimitaton oder durch physiologischen Streß aktiviert und über positive Autoregulation vermehrt (GAIDENKO et al., 1999; VIJAY et al., 2000). Aktives SigmaB führt zur Expression des generellen Streßregulons, infolgedessen die Zellen mit einem multiplen und präventiven Schutz gegenüber verschiedenen Stressoren ausgestattet werden (HECKER & VÖLKER, 1998). Dadurch wird ein Überleben unter Nährstoffmangel- oder anderen widrigen Umweltbedingungen über längere Zeiträume bei gleichzeitiger Präsenz im Ökosystem ermöglicht. Dr. Jörg Bernhardt (Oktober 2000) ||
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Microbial
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Jörg Bernhardt, phone +49 3834 864202, bernhard@microbio2.biologie.uni-greifswald.de 20.03.2000 |
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